《Nature Microbiology》〡sIgM在肠道微生物群稳态中的关键作用：虹鳟鱼模型的启示

（资料来源：肠道菌群探秘）

这篇文章的核心内容是研究分泌型免疫球蛋白M（sIgM）在调节肠道微生物群稳态和新陈代谢中的作用。研究使用虹鳟鱼作为模型，揭示了sIgM在维持肠道微生物群落结构、调节微生物代谢以及保护宿主免受肠道炎症和系统性感染中的重要作用。以下是文章的主要内容概述：

背景知识

●  微生物群与宿主免疫系统的共进化：微生物群与宿主的适应性免疫系统之间存在一种相互依赖的关系，这种关系在所有有颌脊椎动物中都得到了保留。分泌型免疫球蛋白（sIgs）在调节微生物群落结构和功能方面发挥着重要作用。

●  sIgA和sIgT的作用：以往的研究已经确定sIgA和sIgT在维持肠道稳态中起着关键作用。sIgA和sIgT能够促进有益微生物在宿主黏膜表面的定植，并防止病原体穿透宿主黏膜屏障。

●  sIgM的作用：尽管sIgM在人类和鱼类的肠道微生物群中也发挥着重要作用，但其在调节微生物群落结构和代谢中的具体作用尚不清楚。本研究旨在探讨sIgM在肠道微生物群稳态和代谢中的作用。

研究方法

●  虹鳟鱼模型：研究者使用虹鳟鱼作为模型生物，因为虹鳟鱼的IgM在进化上是保守的，并且其肠道微生物群也被sIgM所包裹。

●  IgM耗竭实验：通过注射抗IgM单克隆抗体（mAb）来耗竭虹鳟鱼体内的IgM，观察IgM耗竭对肠道微生物群和宿主健康的影响。

●  微生物群分析：使用流式细胞术和16S rRNA测序技术来分析肠道微生物群的组成和多样性。

●  代谢物分析：通过代谢组学方法分析肠道黏液中的微生物代谢物，包括短链脂肪酸（SCFAs）、胆汁酸和氨基酸。

●  炎症和病理分析：通过组织病理学评分和炎症细胞因子基因表达分析来评估肠道炎症和组织损伤。

实验结果

●  sIgM和sIgT对微生物群的包裹：研究发现，虹鳟鱼肠道微生物群中约17.4%被sIgM和sIgT双重包裹，约17.6%被sIgT单独包裹，约7.3%被sIgM单独包裹。通过16S rRNA测序分析，发现sIgM和sIgT包裹的微生物群落存在一定的重叠，但也有一些特定的微生物群落偏好被一种或另一种Ig包裹。

●  IgM耗竭对肠道微生物群的影响：IgM耗竭导致肠道微生物群的显著变化，包括微生物群落结构的改变、短链脂肪酸和必需氨基酸水平的升高。IgM耗竭还导致肠道微生物群的定植能力下降，以及某些特定微生物群落的扩张，如Deefgea sp.和Clostridium sp.。

●  IgM耗竭对宿主健康的影响：IgM耗竭的虹鳟鱼表现出严重的肠道组织损伤、体重下降、细菌易位和肠道失调。此外，IgM耗竭还导致血液中内毒素水平升高，这表明肠道微生物群可能已经穿透肠道屏障进入血液循环。

●  IgM耗竭对代谢物的影响：IgM耗竭的虹鳟鱼肠道黏液中，短链脂肪酸（如乙酸和丁酸）和胆汁酸（如胆酸）的水平显著升高。此外，所有检测的必需氨基酸和大多数非必需氨基酸的浓度也显著升高。

●  IgM耗竭对DSS诱导的结肠炎的影响：在IgM耗竭的虹鳟鱼中，DSS诱导的结肠炎导致更高的死亡率，这可能是由于肠道微生物群的失调和细菌易位引起的系统性感染。

关键结论

●  sIgM在肠道微生物群稳态中的作用：sIgM在维持肠道微生物群落结构和功能方面发挥着重要作用，其耗竭会导致肠道微生物群的失调和宿主健康问题。

●  sIgM对微生物代谢的调节：sIgM可能通过调节微生物群落结构来影响微生物代谢物的产生，这些代谢物对宿主的生理功能和健康状态具有重要影响。

●  sIgM在肠道炎症和感染中的保护作用：sIgM在保护宿主免受肠道炎症和系统性感染方面具有重要作用，其耗竭会增加宿主对DSS诱导的结肠炎的敏感性。

研究意义

这项研究不仅揭示了sIgM在肠道微生物群稳态和代谢中的新功能，还为理解肠道微生物群与宿主免疫系统之间的相互作用提供了新的视角。这些发现对于开发针对肠道疾病的新型治疗方法具有潜在的应用价值。

研究结果

sIgT和/或sIgM对微生物群的重叠但有偏好的识别

研究目的

●  研究sIgT和sIgM在虹鳟鱼肠道微生物群中的包裹情况：了解这两种免疫球蛋白是否同时或分别包裹肠道微生物群，以及它们对不同微生物群落的偏好性。

●  分析sIgT和sIgM包裹的微生物群落的组成差异：通过16S rRNA测序技术，比较sIgT和sIgM包裹的微生物群落的组成和多样性。

实验方法

●  细菌包裹实验：使用流式细胞术（FACS）对虹鳟鱼肠道微生物群进行染色和分选，检测sIgT和sIgM的包裹情况。

●  16S rRNA测序：对分选后的微生物群落进行16S rRNA测序，分析其组成和多样性。

●  数据分析：使用主成分分析（PCoA）和线性判别分析（LDA）等方法，评估不同包裹模式下的微生物群落差异。

实验结果

1. sIgT和sIgM的包裹比例：

●  约17.4%的虹鳟鱼肠道微生物群被sIgT和sIgM双重包裹。

●  约17.6%的微生物群被sIgT单独包裹。

●  约7.3%的微生物群被sIgM单独包裹。

●  这些结果表明，sIgT和sIgM在肠道微生物群中的包裹存在一定的重叠，但也有各自独特的包裹模式。

2. 微生物群落组成分析：

●  α多样性分析：sIgM+、sIgT+和sIgM/sIgT++包裹的微生物群落的α多样性指标（如Chao1、Faith’s Phylogenetic Diversity、Pielou’s Evenness和Shannon指数）没有显著差异。

●  β多样性分析：通过加权UniFrac距离分析，发现sIgM+微生物群落与其他包裹模式的群落存在显著差异，而sIgT+微生物群落与其他群落的差异不显著。

●  微生物群落组成：sIgT+包裹的微生物群落主要由革兰氏阴性杆菌组成，如Fusobacteriaceae、Chitinobacteriaceae、Deefgea sp.、Shewanella sp.和Flavobacterium sp.。sIgM+包裹的微生物群落则以Mycoplasmataceae、Pseudomonadales和Aeromonadales为主。sIgM/sIgT++包裹的微生物群落中，Crenobacter sp.和Bacillus sp.是显著特征。

3. 微生物关联网络分析：

●  单网络分析预测了每种包裹模式下的微生物关联网络，发现sIgM+包裹的微生物群落以Lactobacillus属为主导。

缺乏sIgM会导致血清内毒素水平升高

研究目的

●  评估sIgM在肠道微生物群稳态中的作用：通过耗竭虹鳟鱼体内的IgM，观察sIgM缺失对肠道微生物群和宿主健康的影响。

●  研究sIgM缺失对血清内毒素水平的影响：内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，其在血清中的升高通常与细菌易位（细菌从肠道进入血液循环）有关。

实验方法

1.     IgM耗竭模型：

●  使用抗虹鳟鱼IgM单克隆抗体（mAb）通过腹腔注射的方式耗竭虹鳟鱼体内的IgM+ B细胞。

●  在注射后6周和9周，通过流式细胞术和ELISA检测血液和肠道中IgM+ B细胞和IgM蛋白的耗竭情况。

2.     肠道微生物群的检测：

●  通过流式细胞术检测sIgM和sIgT对肠道微生物群的包裹情况。

●  使用16S rRNA测序分析肠道微生物群的组成变化。

3.     血清内毒素水平的检测：

●  使用Limulus Amebocyte Lysate（LAL）试剂盒检测血清中的内毒素水平。

实验结果

1.     IgM耗竭效果：

●  在注射抗IgM mAb后6周和9周，血液和肠道中的IgM+ B细胞和IgM蛋白几乎完全耗竭。

●  sIgM包裹的肠道微生物群比例在耗竭后显著下降（约53.3%到97.9%），而sIgT包裹的微生物群比例在大多数时间点上没有显著变化。

2.     细菌易位：

●  在IgM耗竭的虹鳟鱼中，通过荧光原位杂交（FISH）技术检测到肠道组织中有细菌穿透的现象，而对照组鱼中未观察到这种现象。

●  这表明在sIgM缺失的情况下，肠道微生物群能够穿透肠道屏障进入肠道组织。

3.     血清内毒素水平升高：

●  在IgM耗竭后的3周和6周，IgM耗竭鱼的血清内毒素水平显著升高。

●  到了耗竭后的13周，随着sIgM水平的恢复，血清内毒素水平也恢复到对照组水平。

IgM耗竭导致严重的肠道组织损伤和炎症

研究目的

●  评估IgM耗竭对肠道组织的影响：通过IgM耗竭模型，研究IgM在维持肠道组织完整性和防止炎症中的作用。

●  分析IgM耗竭引起的肠道病理变化：观察IgM耗竭后肠道组织的损伤程度和炎症反应的特征。

实验方法

1.     IgM耗竭模型：

●  使用抗虹鳟鱼IgM单克隆抗体（mAb）通过腹腔注射的方式耗竭虹鳟鱼体内的IgM+ B细胞。

●  在注射后3周和6周，对IgM耗竭鱼和对照鱼的肠道组织进行病理学分析。

2.     组织病理学分析：

●  对IgM耗竭鱼和对照鱼的肠道组织进行苏木精-伊红（H&E）染色，观察组织的病理变化。

●  评估肠道组织的病理评分，包括免疫细胞浸润、基底膜脱离、上皮完整性丧失、上皮脱落、水肿和上皮增生等指标。

3.     炎症细胞因子基因表达分析：

●  使用实时定量PCR（qPCR）技术检测肠道组织中炎症细胞因子和抗菌肽基因的表达水平。

实验结果

1.     肠道组织损伤：

●   基底膜脱离：固有层（LP）从上皮层脱离，这是IgM耗竭鱼肠道损伤的一个显著特征。

●   水肿：肠道组织出现明显的水肿现象。

●   上皮损伤：上皮细胞完整性丧失，部分上皮细胞脱落。

●   免疫细胞浸润：大量免疫细胞浸润到肠道组织中，表明炎症反应的发生。

●  IgM耗竭鱼的肠道组织在3周和6周后表现出严重的病理变化，包括：

2.     炎症反应：

●   白细胞介素-1β（IL-1β）

●   白细胞介素-10（IL-10）

●   白细胞介素-17A（IL-17A）

●   抗菌肽基因（如lyz2）

●  IgM耗竭鱼的肠道组织中，多个炎症细胞因子和抗菌肽基因的表达水平显著上调，包括：

3.     ABX处理的对照实验：

●  为了验证IgM耗竭引起的肠道损伤是否由肠道微生物群引起，研究者对IgM耗竭鱼进行了抗生素（ABX）处理，以清除肠道微生物群。

●  结果表明，ABX处理的IgM耗竭鱼未出现显著的肠道组织损伤，这表明IgM耗竭引起的肠道损伤是由肠道微生物群的易位引起的。

sIgM耗竭改变了肠道微生物代谢产物的生成

研究目的

●  评估sIgM在调节肠道微生物代谢中的作用：通过耗竭虹鳟鱼体内的sIgM，研究其对肠道微生物代谢产物的影响，特别是短链脂肪酸（SCFAs）、胆汁酸和氨基酸等关键代谢物的水平变化。

实验方法

1. sIgM耗竭模型：

●  使用抗虹鳟鱼IgM单克隆抗体（mAb）通过腹腔注射的方式耗竭虹鳟鱼体内的IgM+ B细胞，从而减少sIgM的水平。

●  在耗竭后的不同时间点（如6周）收集肠道黏液样本。

2. 代谢物分析：

●  使用靶向代谢组学方法，分析肠道黏液中的短链脂肪酸（SCFAs）、胆汁酸和氨基酸的水平。

●  通过高效液相色谱（HPLC）和质谱联用技术（LC-MS）等方法检测代谢物的浓度。

实验结果

1.     短链脂肪酸（SCFAs）的变化：

●  在sIgM耗竭的虹鳟鱼肠道黏液中，乙酸和丁酸等短链脂肪酸的水平显著升高。

●  这些变化可能与某些特定微生物群落的扩张有关，例如Lachnospiraceae家族的微生物，它们是已知的SCFAs生产者。

2.     胆汁酸的变化：

●  sIgM耗竭的虹鳟鱼肠道黏液中，胆汁酸（如胆酸）的水平也显著升高。

●  这些变化可能与微生物群落的组成变化有关，某些微生物可能通过代谢途径影响胆汁酸的合成和分泌。

3.     氨基酸的变化：

●  sIgM耗竭的虹鳟鱼肠道黏液中，所有检测的必需氨基酸（如组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸）和大多数非必需氨基酸（如精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、酪氨酸和丝氨酸）的浓度显著升高。

●  这些变化可能与肠道微生物群的代谢活动有关，某些微生物可能通过分解蛋白质或合成氨基酸来影响这些代谢物的水平。

DSS诱导的结肠炎加剧了IgM耗竭鱼的死亡率

研究目的

●  评估IgM耗竭对DSS诱导的结肠炎的影响：研究IgM耗竭是否会使虹鳟鱼对DSS诱导的结肠炎更加敏感，从而导致更高的死亡率。

●  探索IgM在结肠炎中的保护作用：通过DSS诱导的结肠炎模型，研究IgM在保护宿主免受肠道炎症和系统性感染中的作用。

实验方法

1. DSS诱导的结肠炎模型：

●  使用3% DSS溶液通过口服灌胃的方式诱导虹鳟鱼的结肠炎。

●  对照组鱼接受等量的水处理。

2. IgM耗竭模型：

●  使用抗虹鳟鱼IgM单克隆抗体（mAb）通过腹腔注射的方式耗竭虹鳟鱼体内的IgM+ B细胞。

●  对照组鱼接受等量的同种型对照抗体处理。

3. 实验设计：

实验分为四组：

●   IgM耗竭鱼接受DSS处理（DSS-IgM耗竭组）

●   IgM耗竭鱼接受水处理（水-IgM耗竭组）

●   对照鱼接受DSS处理（DSS-对照组）

●   对照鱼接受水处理（水-对照组）

4. 观察指标：

●  死亡率：记录各组鱼的死亡率。

●  肠道病理评分：对存活鱼的肠道组织进行病理学评分。

●  肠道长度和体重：测量鱼的肠道长度和体重，计算相对肠道长度（RGL）和K因子（体重与长度的比值）。

●  血清内毒素水平：检测各组鱼血清中的内毒素水平。

●  肝脏细菌培养：对死亡鱼的肝脏进行细菌培养，检测细菌种类和数量。

实验结果

1.     死亡率：

●  DSS处理的IgM耗竭鱼死亡率显著高于DSS处理的对照鱼（54%～60% vs 10%～14%）。

●  水处理的IgM耗竭鱼死亡率较低（0%～5%），表明IgM耗竭本身对鱼的健康影响较小。

2.     肠道病理评分：

●  DSS处理的IgM耗竭鱼肠道病理评分显著高于其他各组，表现为更严重的肠道组织损伤、炎症细胞浸润和上皮损伤。

3.     肠道长度和体重：

●  DSS处理的IgM耗竭鱼和DSS处理的对照鱼的相对肠道长度（RGL）和K因子均显著下降，表明DSS处理导致了肠道缩短和体重下降。

●  水处理的IgM耗竭鱼和DSS处理的对照鱼的K因子也显著下降，表明IgM耗竭和DSS处理均可能导致体重下降。

4.     血清内毒素水平：

●  DSS处理的IgM耗竭鱼血清内毒素水平显著升高，表明系统性细菌感染可能是导致高死亡率的原因。

●  水处理的IgM耗竭鱼血清内毒素水平也有所升高，但程度较轻。

5.     肝脏细菌培养：

●   DSS处理的IgM耗竭鱼肝脏中检测到大量细菌，包括一些已知的致病菌，如Plesiomonas shigelloides、Citrobacter freundii等。

●   这些细菌的存在进一步证实了系统性细菌感染的存在。

讨论

研究总结

●  sIgM在肠道微生物群稳态中的关键作用：

●   研究发现，sIgM在维持肠道微生物群落结构和功能方面发挥着重要作用。sIgM耗竭导致肠道微生物群的显著变化，包括微生物群落多样性的改变和特定微生物群落的扩张。

●   sIgM耗竭还导致肠道组织损伤和炎症反应，表明sIgM在防止微生物群穿透肠道屏障方面具有重要作用。

●  sIgM对微生物代谢的调节作用：

●   sIgM耗竭改变了肠道微生物代谢产物的生成，特别是短链脂肪酸（SCFAs）、胆汁酸和氨基酸的水平显著升高。这些代谢产物的变化可能对宿主的健康产生重要影响。

●  sIgM在结肠炎中的保护作用：

●   在DSS诱导的结肠炎模型中，IgM耗竭显著加剧了结肠炎的严重程度和死亡率。这表明sIgM在保护宿主免受肠道炎症和系统性感染中发挥重要作用。

研究意义

●  进化上的保守性：

●   sIgM在所有有颌脊椎动物中是进化上最古老的免疫球蛋白，其在肠道微生物群稳态中的作用是保守的。这一发现为理解sIgM在宿主-微生物群共进化中的作用提供了新的视角。

●  免疫代谢联系：

●   研究揭示了sIgM通过调节微生物代谢影响宿主健康的机制，这为开发新的治疗策略提供了理论基础。例如，通过调节sIgM的水平或功能，可能有助于治疗肠道炎症性疾病。

研究局限性

●  实验模型的局限性：

●   研究使用了虹鳟鱼作为模型生物，虽然虹鳟鱼在进化上与人类有相似的免疫系统，但其生理和病理机制可能与人类存在差异。因此，这些发现需要在其他模型生物（如哺乳动物）中进一步验证。

●  功能冗余性：

●   研究中发现sIgT和sIgM在包裹肠道微生物群方面存在一定的功能重叠。未来的研究需要进一步探讨sIgM和sIgT在调节微生物群稳态中的功能冗余性和特异性。

未来研究方向

●  sIgM和sIgT的功能差异：

●   未来的研究可以进一步探讨sIgM和sIgT在调节微生物群代谢和宿主健康中的具体差异，以及它们在不同生理和病理条件下的作用。

●  机制研究：

●   研究sIgM如何通过调节微生物群的代谢活动影响宿主的健康，特别是其在肠道炎症和系统性感染中的具体机制。

●  临床应用：

●   探索sIgM在治疗肠道炎症性疾病（如炎症性肠病）中的潜在应用，以及如何通过调节sIgM的水平或功能来改善宿主健康。

结论

●  sIgM的重要性：

●   sIgM在维持肠道微生物群稳态和调节微生物代谢中发挥着重要作用，其耗竭会导致肠道组织损伤、炎症反应和系统性感染。

●  未来展望：

●   这项研究为理解sIgM在宿主-微生物群相互作用中的作用提供了新的视角，并为开发新的治疗策略提供了理论基础。

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